Lumafluor公司的RetroBeads™是用于逆行示蹤的熒光微球，并且是被大量文獻證明有效的微球。數(shù)百篇已發(fā)表的論文證明Lumafluor的Retrobeads™逆行示蹤熒光微球在無脊椎動物到靈長類動物以及所有介于兩者之間的系統(tǒng)中是有效的。

Lumafluor Retrobeads™產(chǎn)品特點：

1)高度受限的注射-非常適合進行詳細的連通性研究。

2)在活細胞中無限期（> 1年！），無毒。

3)與大多數(shù)其他順行示蹤劑，原位雜交和免疫組織化學兼容。

產(chǎn)品訂購：

Lumafuor熒光微球逆行示蹤劑中文使用說明

產(chǎn)品形態(tài)： 隨附的小瓶包含懸浮在蒸餾水中的濃縮珠溶液。如果紅珠用于逆行追蹤神經(jīng)元通路，則溶液可以按原樣使用或稀釋使用。在大鼠視覺皮層中，使用紅珠時，1:4 的稀釋度似乎不會降低逆行標記的質(zhì)量或程度。但是，對于初始實驗，我們強烈建議使用溶液全強度。除蒸餾水外，標準鹽溶液（NaCl、KCl）也可用作稀釋劑。所提供的綠色微球，可以直接用于逆行追蹤實驗。不建議稀釋綠色微球。

產(chǎn)品儲存：珠溶液應(yīng)儲存在加濕容器中，在冰箱中，以防止蒸發(fā)。不要凍結(jié)！被凍結(jié)的珠子將無法工作，也無法挽救。如果珠子變干，它們就不能被重組。這種材料的保質(zhì)期尚未確定，但如果儲存得當，它可以保持幾年的良好狀態(tài)。

產(chǎn)品應(yīng)用：最好使用壓力注射珠子（例如 1 毫升 Hamilton 注射器或加壓空氣注射系統(tǒng)）。對于局部電路工作，已通過具有 30-50 um 直徑的玻璃移液器注入非常少量 (30-50 nl)。對于常規(guī)逆行追蹤，使用更大體積 (0.1-0.3 ul) 和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會擴散到遠離注射部位的地方（通常小于 1 毫米）。因此，為了標記投射到大型結(jié)構(gòu)的所有或大部分神經(jīng)元，應(yīng)該進行幾次注射。不建議將珠子的離子電滲應(yīng)用作為傳遞示蹤劑的有效方法。然而，珠子確實帶有凈負電荷。

生存時間：在大多數(shù)溫血脊椎動物系統(tǒng)中，注射后的最短有效生存時間約為 24 小時。標記強度隨著存活時間的延長而增加，最長可達 48 小時。48 小時后，未觀察到標記強度增加（或減少）。這些值在冷血動物中可能有很大不同，建議初始生存時間為一周。最長存活時間尚未確定，但即使在 14 個月的存活時間后，標簽的質(zhì)量或范圍也沒有變化。單元格可能被標記。未觀察到對動物或神經(jīng)元的毒性作用。

固定和處理：標準固定是用 0.1 M 磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在 0.1 M 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中加入 4% 多聚甲醛。戊二醛會產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，這可能會掩蓋珠標記的神經(jīng)元，應(yīng)盡可能避免。綠色珠子在戊二醛固定材料中將看不見。將冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，安裝在涂有明膠的載玻片上，然后風干。干燥后，可以將載玻片在二甲苯中清洗 1 分鐘，然后用 Fluoromount 或 Krystalon 蓋上蓋子。Fluoromount 購自 Atomergic Chemetals Corp., Farmingdale, NY；來自新澤西州吉布斯敦的 Harleco (EM Industries) 的 Krystalon。

短暫接觸酒精和二甲苯無害，但長時間接觸（超過 5 分鐘）會破壞珠子。珠子對甘油非常敏感，如果安裝在含甘油的溶液中會迅速褪色。在需要使用非透明/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果將載玻片保存在黑暗中，細胞中的標記至少一年不會褪色（盡管背景自發(fā)熒光可能會顯著增加）。到目前為止，在塑料嵌入后保留珠子標記的嘗試尚未成功。

觀察：紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何用于羅丹明的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組會產(chǎn)生非常高的背景，這會使標記的細胞不可見。使用 Zeiss 和 Leitz 標準羅丹明濾光片都獲得了良好的結(jié)果。對于綠色珠子，寬帶熒光素過濾器效果很好。路西法黃的濾光片組提供更強烈的信號，但以更高的背景為代價。窄帶熒光素濾光片會產(chǎn)生比寬帶濾光片弱得多的信號。 即使經(jīng)過長時間的觀察或顯微攝影，珠子也不會明顯褪色。

使用低功率、低數(shù)值孔徑的干式物鏡（例如 X4、X10）通常看不到標記。如果細胞被強烈標記，X10 浸沒物鏡（數(shù)值孔徑為 0.4 或更大）或更高功率的干物鏡通常會顯示細胞。然而，X25 浸沒物鏡通常會顯示非常清晰標記的細胞，而低功率物鏡會錯過這些細胞。這些警告尤其適用于綠珠。在決定實驗不起作用之前，請使用浸入物鏡檢查注射部位附近的部分。應(yīng)該存在許多局部標記的細胞。

綠珠使用者的附加信息：在迄今為止所做的工作中，似乎年輕的動物比年長的動物更好地傳遞標簽。此外，年輕動物的組織自發(fā)熒光較低。因此，如果可能的話，建議在涉及綠珠的實驗中使用年輕的動物。因為綠色珠子在比紅色珠子更短的波長下被激發(fā)，所以組織自發(fā)熒光是一個更大的問題。因此，盡量減少自發(fā)熒光將產(chǎn)生更好的對比度信號。減少自發(fā)熒光的方法包括：

1) 使用更薄的切片（例如 30 um 而不是 40 或 50）

2) 使用較年輕的動物

3) 在蓋玻片后立即檢查切片（背景隨著時間的推移而增加）